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氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞


1. 氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞方法

1.1感受态细胞的制备:

(1)在超净台内操作,用接种环挑取单克隆大肠杆菌的DH5ɑ菌落于2ml LB液体培养基中,37℃振荡过夜。 

(2)将上述培养的细菌按1100的比例转接至5ml LB液体培养基中振荡培养2-3小时。 

(3)将上述生长对数期的菌液置冰上10分钟,4℃离心8000rpm 30秒,弃去上清。 

(4)100mmol/L的氯化钙溶液400ul悬浮菌体,冰浴10min4℃离心,4000rpm 5min,弃去上清。 

5)再把菌体悬浮在400ul冰上预冷的100mmol/L氯化钙溶液中,此菌液即为感受态细菌,按100ul分装在已消毒的Eppendorf管内,置4℃冰箱中备转化用。 

1.2转化: 

1)制冰盒一个,打开净化工作台电源,使其处于工作状态,将水浴锅调至42℃,涂布棒浸泡在75%酒精中,以下操作除孵育、振荡菌液外,其余均需在净化工作台内进行。 

2)从4℃冰箱中取出感受态细菌和从-20℃冰箱中取出质粒DNAEppendorf管各一支,置冰盒内。 

3)在净化工作台内,将质粒DNA 1ul加入感受态细菌100ul Eppendorf管内,混匀,置冰上30min。 

4)然后立即置42℃水浴中90秒,不要摇动试管,取出后置冰盒中冷却2min。 

5)向每管中加入900ul LB液体培养基(无氨苄青霉素),在37℃摇床上温和摇动,转速200 rpm1h。

6)取出37℃预热了30min的LB琼脂固体培养基(含氨苄青霉素100ug/ml)平皿,点上酒精灯,将消毒浸泡的涂布棒凉干。 

7)将转化的感受态细胞用涂布棒均匀地涂布在LB琼脂固体培养基(含氨苄青霉素)平皿上,做上标记。 

8)铺菌平皿倒置在培养箱中,37℃培养12h,长出单菌落。 

9)取消毒玻璃试管一支,加3ml LB液体培养基、3ul氨苄青霉素(0.1mg/ul),将培养出的单菌落用消毒牙签或接种棒挑出一个菌落融入试管,置37℃摇床上温和摇动,转速200 rpm12h 

注意事项 

1.制备感受态细胞前,一定要保证培养的宿主菌处于对数生长期且繁殖代数应基本一致,这也是细菌做转接培养并测其OD值的原因。 

2.制备感受态细胞过程中,每一步操作要轻柔,尤其是悬浮细胞时要避免用旋祸混合器。 

3.在实验室制备的感受态细胞做转化42℃热休克并冷却时,时间准,动作快。

4.转化菌涂平板前抗生素的量要足够,涂布细菌时菌量不要太多,培养时间不过16h。否则抗生素会失效,未转化菌也会生长。


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